大鼠Ⅱ型胶原α1(COL2a1)检测试剂盒

大鼠Ⅱ型胶原α1(COL2a1)检测试剂盒
简介
Ⅱ型胶原α1(COL2a1)是一个 II 型胶原蛋白的α-1 链，II 型胶原蛋白是一种纤维状的胶原蛋白，存在于软骨和眼睛的玻璃体中，该基因的突变与软骨发育 不全、早发性家族性骨关节炎、先天性 SED、Langer-Saldino 软骨发育不全、Kniest发育不全、Stickler 综合征I型和Strudwick 型脊柱骨骺线发育不全 有关，加工软骨素的缺陷也与软骨发育不良有关，软骨素是一种钙结合蛋白，是这种胶原分子的C肽，II 型胶原蛋白可增加结缔组织的结构和强度，主要存在于软骨、填充眼球的果冻状物质（玻璃体）、内耳以及脊柱中椎体之间的椎间盘中心部分（髓核），三个 pro-alpha1(II)链缠绕在一起，形成一个三股的、像绳索的procollagen 分子，这些原胶原蛋白分子必须由细胞内的酶来处理，一旦这些分子被处理，它们就会离开细胞并排列成长而 细的纤维状，在细胞周围的空间中相互交联，交联的结果是形成非常强大的成熟II型胶原蛋白纤维。

检测原理

试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物COL2a1，清洗后，再加入标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体"免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中COL2a1的浓度。

操作要点

1. 混合蛋白质溶液时，应始终避免起泡。为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。此外，每种试剂应单独使用容器。

2. 确保试剂不间断地添加到板孔中。为了确保准确的结果，在孵育步骤中需要粘合好封板膜。

3. 当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。

4. 显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。显色剂应从无色变为蓝色。

5. 应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表示终止液未与基质溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；

2. 移液器及枪头；

3. 蒸馏水或去离子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；

6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀释标准品和样品的试管。
注意事项

1. 本试剂盒提供的终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。

2. 本试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。

3. 显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

4. 佩戴防护手套、眼睛和面部防护用品，处理后洗手。

试剂准备

1. 使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。

2. 洗涤液/稀释液配置：如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1: 20稀释（例如：1mL浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
大鼠Ⅱ型胶原α1(COL2a1)检测试剂盒
标准品配置

试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从60ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至3000pg/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的3000pg/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将3000pg/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为:  3000pg/mL、 1500pg/mL、 750pg/mL、 375pg/mL、 187.5pg/mL、 93.75pg/mL、 46.88pg/mL，从浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0pg/mL)。

结果的计算
计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线（作图时去掉空白组的值）或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
示例数据

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

本图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果
灵敏度

经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为23.44pg/mL。

特异性

该试剂盒测定可识别天然和重组大鼠COL2a1。

其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。

实验步骤汇总
1. 加标准品及样品，37℃避光反应1.5h，洗涤3次。

2. 加检测抗体，37℃避光反应1h，洗涤4次。

3. 加酶结合物，37℃避光反应30分钟，洗涤4次。

4. 加显色液，37℃避光反应15分钟。

5. 加终止液，在5分钟内读数。

大鼠Ⅱ型胶原α1 ELISA检测试剂盒用于定量检测细胞培养上清、血清、血浆中大鼠的COL2a1、使用本产品之前，必须完整阅读本说明书，大鼠ELISA试剂盒仅供科研使用，不能于其它诊断。