小鼠Flag标签(Flag-tag)检测试剂盒

小鼠Flag标签(Flag-tag)检测试剂盒
简介
FLAG标签，或FLAG八肽，或FLAG表位，是一种多肽蛋白质标签，可以用重组DNA技术添加到蛋白质中，其序列图案为DYKDDDDK（其中D=天冬氨酸，K=赖氨酸），它是最特异的标签之一，是一种通用种属工抗原，已经开发出特异的、高亲和力的单克隆抗体，因此可用于亲和层析法的蛋白质纯化，也可用于定位活细胞内的蛋白质，它已被用于分离重组的、过量表达的蛋白和宿主生物体表达的野生型蛋白，它还可用于分离具有多个亚单位的蛋白质复合物，因为其温和的纯化过程往往不会破坏这种复合物，它已被用于获得足够纯度和质量的蛋白质，以通过X射线晶体学进行三维结构测定，FLAG标签可用于许多需要抗体识别的不同检测中，如果没有针对某一特定蛋白的抗体，在蛋白上添加FLAG标记，就可以用针对FLAG序列的抗体来研究该蛋白，例如通过免疫荧光、免疫沉淀或通过SDS PAGE蛋白电泳和Western印迹检测进行细胞定位研究，从N端到C端的FLAG标签的肽序列是，DYKDDDDK（1012Da），此外，它还可以串联使用，常见的是3xFLAG肽，DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK（标签编码一个肠激酶裂解位点），它可以与蛋白质的C端或N端融合，或插入到蛋白质内，一些市售的抗体（如 M1/4E11）只有在N端出现时才能识别该表位，然而，其他可用的抗体（如M2）则对位置不敏感，FLAG标签中的残基可以被硫酸化，这可能会影响抗体对FLAG表位的识别，FLAG标签可以与其他亲和力标签一起使用，例如多标签（His标签）、HA标签或myc标签。

检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术:将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物Flag-tag，清洗后，再加入抗体标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体"免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中Flag-tag的浓度。

操作要点

1. 混合蛋白质溶液时，应始终避免起泡。为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。此外，每种试剂应单独使用容器。

2. 确保试剂不间断地添加到板孔中。为了确保准确的结果，在孵育步骤中需要粘合好封板膜。

3. 当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。

4. 显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。显色剂应从无色变为蓝色。

5. 应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表示终止液未与基质溶液充分混合。

需要的其他材料

1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；

2. 移液器及枪头；

3. 蒸馏水或去离子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；

6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀释标准品和样品的试管。

注意事项

1. 本试剂盒提供的终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。

2. 本试剂盒中的某些成分含有防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。

3. 显色剂B可能会引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

4. 佩戴防护手套、眼睛和面部防护用品，处理后洗手。

试剂准备

1. 使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。

2. 洗涤液/稀释液配置：如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1: 20稀释（例如：1mL浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）

标准品配置

试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从160ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至8ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的8ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将8ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为:  8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL、 0.125ng/mL，从高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。

结果的计算

计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线（作图时去掉空白组的值）或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

小鼠Flag标签(Flag-tag)检测试剂盒
示例数据

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

本图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果
灵敏度

经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.06ng/mL。

特异性

该试剂盒测定可识别重组小鼠Flag-tag。

其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。

实验步骤汇总
1. 加标准品及样品，37℃避光反应1.5h，洗涤3次。

2. 加检测抗体，37℃避光反应1h，洗涤4次。

3. 加酶结合物，37℃避光反应30分钟，洗涤4次。

4. 加显色液，37℃避光反应15分钟。

5. 加终止液，在5分钟内读数。

小鼠Flag标签ELISA检测试剂盒用于定量检测细胞培养上清、血清、血浆中小鼠的Flag-tag使用本产品之前，必须完整阅读本说明书，小鼠ELISA试剂盒仅供科研使用，不能于其它诊断。