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ELISA实验操作的显色和比色
发布时间:2019-09-18   点击次数:201次

(一) 显色

 

显色是ELISA中的后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。

适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显se情况适当缩短或延长反应时间,及时判断。

 

OPD底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深,再延长反应时间,可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色,显色反应应避光进行,显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD产物用硫酸终止后,显色由橙黄色转向棕黄色。

 

TMB受光照的影响不大,可在室温中置于操作台上,边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性,宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后,约40分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,至2小时后即可完全消退至无色。

TMB的终止液有多种,叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪,是目视判断的良好终止剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

 

(二)比色

 

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体,然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验,需先将板置于标准96孔的座架中,才可进行比色。

在加底物液显色前,先将软板边缘剪净,这样,此板就可完全平妥坐入座架中。 比色时应先以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记录本次试验的试剂状况。

其后可用空白孔以蒸馏水校零点,以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行计算。

 

比色结果的表达以往通用光密度(oplical density,OD),现按规定用吸光度(absorbence,A),两者含义相同。通常的表示方法是,将吸收波长写于A字母的右下角,如OPD的吸收波长为492nm,表示方法为"A492nm"或"OD492nm"。

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