一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37C水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10m预热的DMEM培养基，轻轻吹

匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。

加入10mIDMEM培养基清洗，弃上清液。加入10mIDMEM培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时，去培养基，10mIPBS清洗2次。加入3mI含0.25%EDTA，放人细胞培养箱3min。加人1mIDMEM

培养基终止消化，转移至15ml离心管。

加入10mIPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10mIPBS(经高压灭菌，保存于40C)，吹

匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%~90%时，去培养基，10mIPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA，放人细胞培养箱3min。加入ImIDMEM

培养基终止消化，转移至15ml离心管。加入10mIPBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入Iml冻存液(90%血清，10%DMSO)，放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80C冰箱内，过夜，

第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：

①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶

液。

②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照下列步骤操作：

①确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶

液。

②确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。

③确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。

④确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。为了方便单手开启瓶盖，实验开始可以把所有瓶盖旋松。

③尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75%酒精的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接

触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。

操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净的，必须及时更换。

实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，后用75%酒精清洁台面。