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细胞冻存生物材料准备
发布时间:2019-03-06   点击次数:104次

生物材料准备

    生物材料冻存前进行的准备工作可能会对冻存结果产生影响。对于非复制性材料,如组织,核酸和蛋白等,准备过程包括确认生物材料处于合适的溶液或冻存培养基中,此步骤的目的在于复苏时达到zui大化的预期用途。然而,活细胞和微生物的稳定性及复苏活力受生长条件和冻存前准备工作的影响。

    细胞冻存前需考虑多种因素,包括细胞类型、活力、生长条件、生理状态、数目以及细胞前处理等。当建立一个新分离株或细胞系的初次种子储备时,必须对培养物进行检测并消毒,确保微生物污染的zui小化。每次准备工作后,以及每次准备新批次的培养物时,均要重复这个步骤。

微生物

    生长于通气培养条件下的微生物细胞,特别是细菌和酵母,表现出比生长于非通气条件下的细胞更强的耐受冷却和冻存伤害 的能力。T.Nei 认为,在通气培养条件下,细胞通透性更好,且开放条件下培养细胞在冷却过程中比非通气条件下培养的细胞失水更快。另外,针对微生物细胞,在对数生长期后期及稳定期早期获得的细胞表现出更强的冰冻耐受性。从生长后期和静态培养早期收集的微生物细胞比生长早期和生长晚期的细胞表现了更强的冰冻耐受性。

    一般来讲,初始冻存的细胞数目越多,复苏率越高。对于大多数细菌和酵母而言,保证约 107/ml 的细胞数才能确保足够数量的细胞复苏。由于这些细胞可便捷地从琼脂培养板或斜面上收集,如果需要更大量的细胞,也可使细胞生长于液体培养基中通过离心收集,在任何一种情况下,细胞通常悬浮在包含冻存保护剂的新鲜培养基中。原生生物可以通过离心浓缩,但通常需要悬浮于使用的培养基中,之后使用等体积含冻存保护剂的新鲜培养基稀释。

    针对芽孢菌冻存,需要收集芽孢并重悬于含冻存保护剂的新鲜培养基中。冻存前,必须缩短操作时间且确保芽孢并未萌发。针对非芽孢菌冻存,冻存前需采用特殊程序收集菌丝体。某些具硬菌丝体的真菌,需将含有菌丝体的琼脂块从培养基中切出,并将其置于含冻存保护剂的新鲜培养基中。硬菌丝体无法与琼脂培养基很好粘附,生长于肉汤培养基中时,冻存前需将菌丝体团进行混合。

    冻存材料的活力和复苏率由冻存前后的培养和生长状态决定。活力是衡量培养物生长和繁殖的一项指标。例如原生生物材料等某些材料,需经过多次传代才能保证其稳定性。复苏细胞数量的估算有多种方法,包括连续稀释,平板计数或直接细胞计数。通过对比冻存前和复苏后细胞数量的差异,可说明细胞复苏程度 或冻存过程是否成功。

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