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实验制得细胞的样本,您需做好这六步两注意
发布时间:2019-03-27   点击次数:128次

    我们在做一项实验的时候,需要了解的步骤与所需物品是必不可少的。而今天,上海酶联这里要给朋友们分享的就是实验制得细胞的样本,您需做好下文中的这六步两注意。所谓的六步两注意也就是操作的六个步骤,和两条注意事项,下面我们就来详细的看看吧。

实验之前,我公司的技术人员为朋友们特别准备说明了所需的物品有哪些:
1、培养基;不含酚红的DMEM培养基
2、处理玻片:将多聚赖氨酸溶液(溶于1mol/L pH7.0 Tris-HCl缓冲液中),涂布于玻片上,干燥后即可使用。或者APES 2ml溶于100ml丙酮中,将玻片浸泡入内,取出晾干,180℃干燥备用。
3、洗涤液;0.1M,pH7.2~7.4PBS
4、细胞固定液:4%多聚甲醛0.1MPBS(pH7.2~7.4)含有1/1000 DEPC。
5、乙醇:70%  90%  100%
6、胃蛋白酶溶液:用0.1N HCl将其稀释为100μg/ml
7、设备:烤箱,CO2培养箱,倒置显微镜,玻璃载玻片,原位杂交专用盖玻片,温箱,加样器和吸头等。
操作步骤:
1、在37℃ 5% CO2条件下将细胞加在处理的载玻片上,用培养基培养,时间通过预实验确定;
2、细胞长好后,用洗涤液洗2分钟×3次,室温下将其放入细胞固定液中固定30-60min,蒸馏水洗涤;
3、室温下用洗涤液充分洗涤固定细胞,(干燥后-20℃冰冻保存2周以上)
4、杂交前将固定的细胞进行如下处理;依次在70%,90%,100%的乙醇中浸泡,脱水每次5min,用二甲苯洗涤,除去残留脂质依次在100%,90%,70%乙醇中浸泡,进行再水化,每次5min,zui后浸泡于洗涤液中;
5、在37℃用胃蛋白酶溶液10min处理固定的细胞,以增加细胞对大分子试剂的通透性,再用洗涤液洗5min;
6、用1%甲醛固定10min,用洗涤液洗净。
注意!
    1、所有溶液都必须用RNA酶抑制剂处理。
    2、操作中重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

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