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如何进行单个细胞的PCR分析
发布时间:2019-08-07   点击次数:81次

单个二倍体细胞

在分析单精zi以前,Li等人对个体二倍体细胞内的β珠蛋白基因进行过研究。两 个组织培养细胞株用于这些实验。其中一个纯合是镰刀型细胞密码子6(βS)发生突 变,另一个纯合子则来源于正常的βB等位基因。扩增含有密码子6的β珠蛋白片段的 引物,及能够区别这两个特异的等位基因的寡核苷酸探针(ASO)已经报道过。βA纯 事细胞和βB纯合细胞和βS纯合细胞在同一组织培养瓶中共同培养数天。将用相差显 微镜观察到的混合培养的单个细胞转入溥塑料胡管内。

 

分别将单个细胞转入含裂解液 的PCR管中,保温后,加入PCR缓冲液,缓中有四种dDNP.Taq dna聚合酶和扩增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分钟变性靶DNA,然后根据已发表方法的改进方案进行 50全循环的扩增。通过打点杂交,等量的扩增产物打点于尼龙膜后,扩增产物分别与 βA和βS的探针杂交。所分析的37个细胞中,84%细胞只与βA和βS探针杂交,杂交 强弱各不相同;19个与βA探针.12个与βS探针杂交。

 

12个以水作空白对照的反应管 中瓜呈阴性,它表明忽略不记DNA的污染。没有与两种探针都杂交的样品,它暗示转 入到反应管中的单个细胞,而且组织培养基中存在的从βA或βS细胞中裂解出来的 DNA并未吸附在单个细胞上。

 

单个细胞的pcr扩增产生的β珠蛋白基因的数量通过与已知携带蛋白基因的质粒 DNA样品在杂交模上的杂交信号的强度进行比较确定。据估计PCR反应开始时,一个二 倍体细胞珠蛋白DNA量(3.0X10-24摩尔)在5-500毫微微摩尔之间,每个PCR循环以 平均效率65%计算,经50个循环后它的DNA相当于平均扩增了7.6×1010倍。考虑到扩 增的程度之大,因此排除任何可能的污染对于单个细胞的分析十分关键。

 

单精zi的分析

我司等人随后对位于染色体19编码LDL受体(LDLr)的基因的杂合体单精zi的基因型 进行分析。根据已知的DNA序列,他们用PCR和ASO分析检测LDLr的RFLP。PCR的引物和 探针以前已有报道。单个精zi的分离与二倍体细胞的分离方法一样,经蔗糖梯度 离心得到纯化的精zi,精zi于-20℃可保藏8个月。

 

显微镜下将单个精zi吸入毛细塑 料针管内,然后转入试管内以作裂解。裂解的方法与发表的方法冲液(50mM KCL, 10mM Tris.HCL,pH8.3,2.5mM MgCl2,0.1mg/ml明胶),0.05mg/ml蛋白酶K,20mM DTT和1.7μM SDS。37℃保温1小时,加入pcr反应物以前,样品加热到85℃。PCR扩 增。

 

对80个精ziLDLr基因型已作过分析。55%的雄配子显示出杂交信号。22个携带 LDLr等位基因,21个携带LDLr2基因。仅一个与两种探针杂交都呈阳性。16支对照反 应管中加入所有反应试剂但没有精zi,结果无杂交信号出现。

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