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细胞转染需求注意的6大点
发布时间:2020-05-09   点击次数:60次

1、血清


A、DNA-阳离子脂质体复合物构成时不能含血清,由于血清会影响复合物的构成。


B、一般细胞对无血清培养能够耐受几个小时没问题,转染用的培养液能够含血清也能够不加,但血清一度曾被以为会降低转染效率,转染培养基中参加血清需求对条件进行优化。


C、关于对血清缺乏比较敏感的细胞,能够运用养分丰厚的无血清培养基,或许在转染培养基中运用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞,建议运用专用转染试剂。有条件的话,能够用无血清培养基代替PBS洗细胞两遍,注意洗的时分要轻,靠边际缓缓参加液体,然后不要吹吸细胞,而是滚动培养板让液体滚动在细胞表面。假如洗的太厉害,细胞又损失一部分,加了脂质体后,细胞受影响就更大了,死亡细胞会增多。


2、抗生素(PS)


抗生素,比如青霉素和链霉素,是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般关于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素能够进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能运用抗生素,甚至在预备转染前进行细胞铺板时也要防止运用抗生素。这样,在转染前也不用润洗细胞。关于稳定转染,不要在选择性培养基中运用青霉素和链霉素,ICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外,为了保证无血清培养基中细胞的健康成长,运用比含血清培养基更少的抗生素量。


3、细胞状况


这点非常重要,不要急于求成,必定要让细胞处于jia的成长状况再做。有文献说传代不要超越17代。细胞复苏后的3代左右时细胞状况hao,不要用传了许多代的细胞去做,细胞的形态都会发生改变。大多数已建立的细胞系都是非整倍体,原代培养包含了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在试验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控改变等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的改变。假如随时刻发现这种改变,消融一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。


4、细胞铺板密度


用于转染的jia细胞密度根据不同的细胞类型或使用而异。因转染试剂对细胞有毒害效果,细胞太少,容易死。一般转染时,贴壁细胞密度为70%-90%,悬浮细胞密度为2-4×106细胞/ml,确保转染时细胞没有长满或处于静止期。由于转染效率对细胞密度很敏感,所以在不同试验间坚持一个根本的传代步骤很重要。


5.启动子的选择

 

取得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中能够取得高表达活性。同其他启动子,如SV40和RSV(劳斯肉瘤病毒)相比,在BHK-21中其活性高。这三种病毒启动子在T细胞来历的细胞系,如Jurkat中组成表达水平较低。


6、DNA量


高质量的DNA关于进行的转染至关重要。转染的质粒必定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul。产物表达,48小时mRNA表达gao;72h蛋白表达gao。

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